INTRODUÇÃO Esta experiência tem como objectivo observar a acção da amilase salivar sobre o amido. O amido é um polissacarídeo constituído por um grande número de monossacarídeos (glicose) unidos por ligações glicosídicas (reacção entre dois grupos hidroxilo com libertação de uma molécula de água). É insolúvel em água, não tem sabor doce e é desdobrado em maltose (e esta em glicose)(figura 1) através de várias reacções químicas catalisadas por enzimas específicas: a amilase salivar e pancreática. Figura 1- Molécula de maltose. A enzima que estudámos foi a amilase salivar ou ptialina a qual é segregada pelas glândulas salivares. As enzimas são proteínas compostas por aminoácidos e actuam como biocatalisadores que regulam a velocidade de muitas reacções químicas envolvidas no metabolismo celular. A substância sobre a qual uma enzima actua chama-se substrato. Este ao ligar-se ao centro activo da enzima é desdobrado formando-se duas substâncias, dando-se a esta reacção o nome de catabolismo; ou então, liga-se a outro substrato formando um produto final, reacção anabólica (figura 2). Para que estas reacções se dêem é necessária energia à qual se dá o nome de energia de activação. Figura 2- Acção da enzima sobre o substrato. Nesta experiência utilizaram-se seis tubos de ensaio para testar o meio óptimo onde a enzima actua sobre o amido: utilizou-se HCl para se obter um meio ácido; utilizou-se gelo para se obter um meio frio; ferveu-se saliva para simular as temperaturas altas. Os testes da água iodada e do licor de Fehling foram executados nesta experiência. A água iodada fica azul no caso da solução conter amido; se não, fica incolor. O licor de Fehling, após aquecimento da lamparina, fica com um precipitado cor de tijolo se contiver muitos açúcares redutores. A reacção do licor de Fehling com os açúcares redutores está expressa na figura 3. Figura 3- Reacção do licor de Fehling com os açúcares redutores e escala de cores. PROTOCOLO EXPERIMENTAL MATERIAL saliva cozimento de amido a 1% soro fisiológico a 1% HCl pepsina água iodada 2 gobelés 40 ml seis tubos de ensaio suporte para tubos de ensaio pipetas graduadas pinça de madeira lamparina conta-gotas banho-maria gelo licor de Fehling METODOLOGIA Prepare 6 tubos de ensaio e etiquete-os. Estimule a produção de saliva e recolha-a. Faça uma diluição de 1:1 em soro fisiológico. Coloque 1 ml de saliva diluída num tubo de ensaio e ferva. Depois deixe-o arrefecer. A cada tubo adicione 1 ml das substâncias indicadas, no quadro 1. Tubos Substâncias a adicionar 1 2 3 4 5 6 Amido • • • • • • Saliva • • • HCl • Saliva fervida • Pepsina • Quadro 1- Conteúdo dos vários tubos. Adicione a cada tubo, 3 gotas de água iodada. Tape os tubos e agite-os. Coloque os tubos 1, 2, 3, 4 e 6 em banho-maria, a 37ºC e o tubo 5 em gelo. Ao fim de 15 minutos remova os tubos do banho-maria e do gelo. Registe os resultados. Faça o teste do licor de Fehling, nos 6 tubos. Registe os resultados. Figura 4- Algumas precauções para o sucesso da experiência. RESULTADOS Figura 5- Resultados finais obtidos nos tubos de ensaio. Testes Tubos Conteúdos Cor inicial (água iodada) Cor ao fim 15 minutos Cor final (Licor de Fehling) 1 1 ml saliva + 1 ml amido Incolor Incolor Precipitado cor de tijolo 2 1 ml saliva + 1 ml HCl + 1 ml amido Incolor Rosa Amarelado 3 1 ml saliva fervida + 1 ml amido Incolor Incolor Rosa velho 4 1 ml amido Azul Rosa Violeta 5 1 ml saliva (no gelo) + 1 ml amido Azul Arroxeado Precipitado cor de tijolo 6 1 ml pepsina + 1 ml amido Azul Azul Precipitado cor de tijolo Quadro 2- Quadro de resultados obtidos ao longo da experiência da digestão do amido pela amilase salivar. DISCUSSÃO No tubo 1, contendo saliva e amido, efectuou-se o teste da água iodada e observou-se que não continha amido pois estava incolor. Ao fim de 15 minutos em banho-maria a 37ºC a cor manteve-se, ou seja, não continha amido. Quando se fez o teste do licor de Fehling formou-se um precipitado cor de tijolo o que indica a presença de açúcares redutores. Como o amido é desdobrado em duas moléculas de maltose e estas são açúcares redutores, concluiu-se que houve digestão do amido no tubo 1. No tubo 2, contendo saliva, HCl e amido, efectuou-se o teste da água iodada e observou-se que não continha amido pois estava incolor. No entanto, isto não devia ter sucedido pois o tubo devia ter ficado azul devido à acção do HCl sobre a amilase salivar, o qual quebra as ligações peptídicas da enzima. Ao fim de 15 minutos em banho-maria a 37ºC o tubo passou a rosa o que indica que a amilase desdobrou uma pequena parte do amido mas não na totalidade devido ao HCl. Quando se fez o teste do licor de Fehling o tubo ficou amarelo o que indica uma pequena quantidade de açúcares redutores. No entanto, o resultado não devia ter sido este. Constatou-se então que se obteve este resultado devido a um erro de execução pois devia-se ter colocado no tubo primeiro a saliva e o HCl para este neutralizar a enzima e só depois o amido. No tubo 3, contendo saliva fervida e amido, efectuou-se o teste da água iodada e observou-se que não continha amido pois estava incolor. No entanto, isto não devia ter acontecido. O tubo deviater ficado azul pois quando a saliva é fervida, devido às altas temperaturas a amilase salivar fica desnaturada impedindo a enzima de actuar sobre o amido, não havendo portanto o seu desdobramento, e mesmo que se volte a baixar a temperatura ela permanece desnaturada. Ao fim de 15 minutos em banho-maria a 37ºC, o tubo manteve-se incolor quando devia estar azul pelas razões atrás mencionadas. No teste do licor de Fehling obteve-se a cor rosa velho indicando uma pequena quantidade de açúcares redutores, os quais não deviam existir. Concluiu-se que a saliva não ferveu totalmente, ou seja, uma pequena parte das enzimas permaneceu activa. No tubo 4, contendo apenas amido, efectuou-se o teste da água iodada e, como se esperava, obteve-se a cor azul que indicava que o amido não tinha sofrido alterações. Ao fim de 15 minutos em banho-maria a 37ºC, o tubo encontrava-se rosa, o que indicava que o amido não tinha sofrido alterações significativas. No teste do licor de Fehling o tubo ficou violeta o que indicava que não continha uma quantidade significativa de açúcares redutores1. Estes resultados já se esperavam pois não havia quaisquer substâncias a actuar sobre o amido. No tubo 5, contendo saliva e amido e depois colocado no gelo, efectuou-se o teste da água iodada obtendo-se a cor azul que indicava que contém amido. Ao fim de 15 minutos no gelo o tubo continuava entre o azul e o roxo o que indicava que o amido continuava inalterado. Isto deve-se às baixas temperaturas actuarem sobre a amilase tornando-a inactiva. No entanto, quando se fez o teste do licor de Fehling observou-se um precipitado cor de tijolo que indicava que tinha ocorrido a digestão do amido. Ela ocorreu devido ao tempo que é necessário para se fazer o teste do licor de Fehling durante o qual a enzima torna-se activa devido à variação da temperatura, começando imediatamente a actuar sobre o amido. No tubo 6, contendo pepsina e amido, efectuou-se o teste da água iodada e, como se esperava, obteve-se a cor azul que indica que o amido não sofreu a acção da pepsina. Ao fim de 15 minutos em banho-maria a 37ºC a cor manteve-se, o que indicava que o amido continuava inalterado. No entanto, quando se efectuou o teste do licor de Fehling obteve-se um precipitado cor de tijolo que indicava que a solução continha açúcares redutores. Concluiu-se então que a pepsina estava contaminada com açúcares redutores, uma vez que não houve a digestão do amido. A razão pela qual este tubo foi incluído nesta experiência foi a de observar se cada enzima é específica de um só substrato, ou seja, se a amilase salivar é a única enzima capaz de actuar sobre o amido. 1 Pode-se ter formado uma pequena quantidade de açúcares redutores devido à acção da chama da lamparina quebrando assim as ligações glicosídicas do amido. CONCLUSÃO Com esta experiência, concluiu-se que a amilase salivar é uma enzima específica do amido, que tem uma temperatura óptima de funcionamento nos 37ºC e tem um pH óptimo de funcionamento igual a 7, isto é, neutro. Concluiu-se também que a amilase fica inactiva com as temperaturas baixas mas à medida que se vai aumentando a temperatura ela fica novamente activa. No entanto quando se aumenta muito a temperatura a enzima fica desnaturada e mesmo que se volte a descer a temperatura ela permanece desnaturada. Observou-se também, no tubo 5, que ela actua muito rapidamente sobre o amido, desdobrando-o numa questão de minutos. A amilase salivar é destruída num meio ácido, como se observou no tubo 2. No que respeita ao amido, concluiu-se que este é desdobrado em maltose que é um açúcar redutor. A acção da amilase salivar sobre o amido observada nesta experiência pode ser traduzida por meio de uma reacção química esquematizada na figura 6. Figura 6- Reacção química da acção da amilase salivar sobre o amido. AUTO-CRÍTICA A experiência realizada foi de fácil execução e muito educativa. Cometeram-se alguns erros na sua execução (talvez por distracção), o que prejudicou um pouco os resultados que se esperavam. No entanto, acho que a experiência estava incompleta porque faltou testar a acção da amilase salivar num meio básico. Podia-se ter colocado num tubo 7, saliva juntamente com NaOH adicionando depois o amido. As pessoas responsáveis pelo laboratório de TLB (professores de TLB ou CTV) deviam adquirir uma pepsina nova pois está claro que a que se utilizou está contaminada com açúcares redutores. Por isso é de tomar nota a pepsina, num inventário de reagentes que são necessários adquirir pela escola. Aproveito também para agradecer à professora de TLB que me deixou entregar este relatório mais tarde, devido a um problema que tive com o computador onde o executava. BIBLIOGRAFIA Leite, Ana et al, Do microscópio à célula, Bloco 1, 1ª Edição, Areal Editores, Porto, 1994. Leite, Ana et al, Da célula ao organismo, Bloco 2, 1ª Edição, Areal Editores, Porto, 1996. Copyright 1996 Todos os direitos reservados